經典載體構建流程教材(PPT 23頁)

經典載體構建流程
I載體構建流程
提取mRNA
RT
PCR得到目的基因
PCR常出現的問題
解決方法
PCR產物純化
酶切目的基因和載體
酶切注意事項
酶切常見問題
純化酶切產物
連接
轉化
菌落PCR
酶切檢測陽性克隆
挑取陽性克隆去測序
由於真核基因是由非編碼的內含子將ORF分隔開來的斷裂基因，
若以基因組為模板PCR得到的片段克隆進載體，
不能在原核細胞剪接內含子，
也不能在非對象真核細胞中正確剪接表達。
所以要克隆真核蛋白基因，需以不含內含子的連續編碼的mRNA為模板。
PCR耐熱酶不能直接以mRNA為模板擴增，
必須通過逆轉錄酶將mRNA逆轉錄為cDNA,再以cDNA為模板擴增目的基因。
根據不同的目的，可有三類引物選擇
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